Laboratorio de Biotecnología Animal

Investigación

Lineas de Investigación

  • Transferencia nuclear (clonación) en especies equina, bovina, ovina, porcina y felina.
  • Transgénesis mediada por espermatozoides.
  • Clonación de ovocitos.
  • Haploidización de células.
  • Mejoramiento en eficiencia de clonación de embriones ovinos.
  • Uso de inhibidores alternativos (dihidroleucodina) de la meiosis en ovocitos bovinos.
  • Producción de embriones transgénicos felinos por ICSI.
  • Producción y aislamiento de células madres (stem cells).

Proyecto:
Desarrollo de Técnicas de Transferencia Nuclear para el Clonado de Variedades Transgénicas en Especies de Granja.

La técnica a desarrollar consiste en la producción de animales transgénicos a partir de embriones resultantes de la fusión de ovocitos enucleados y células previamente transfectadas con el gen de interés. Este método ha sido aplicado con éxito para la producción de ovejas que expresan factor IX de coagulación en la leche (Schnieke et al. 1997) y cabras y vacas en las que se introdujo un gen marcador o la genes de proteínas humanas para que se expresen en leche (Keefer et al. 1999; Cibelli et al. 1998, Salamone et al., 2003).

Metodología

La técnica de clonación, propuesta en el presente proyecto, requiere la enucleación de ovocitos y células donantes. Los ovocitos se obtienen, de ovarios de animales sacrificados, o por recuperaciones periódicas ecográficas o laparoscópica.

Los ovocitos deben ser madurados in vitro, lo que consiste básicamente en cultivo de ovocitos, en presencia de hormonas, por un período de 20 a 24 horas. Durante este lapso, los ovocitos completan su primera maduración meiótica y son aptos para la fecundación.

A los ovocitos maduros se les extirpa luego el núcleo mediante micromanipulación. La confirmación de la remoción del material nuclear se realiza por tinción y requiere microscopía de fluorescencia.

Las células donantes del núcleo pueden ser de origen fetal (e.g. fibroblastos) o de animales adultos. Las primeras ofrecen la ventaja de su prolongada capacidad de multiplicación en cultivo, mientras que trabajar con células de animales adulto permite seleccionar animales con un fenotipo superior.

La ventaja de la clonación es que permite trabajar con millones de células que se mantienen en cultivo in vitro, las cuales pueden ser sometidas a la transfección con la construcción deseada. Luego se puede seleccionar las células que poseen el transgen usando en la construcción un gen de resistencia a antibióticos. Las células transfectadas serán resistentes al agregado del antibiótico, las no transgénicas morirán.

La siguiente etapa consiste en la introducción de la célula previamente seleccionada por la presencia del transgen, dentro de la zona pellucida que rodea al ovocito previamente enucleado. La fusión de las membranas se efectúa mediante un pulso de corriente continua de breve duración.

Las cigotas reconstituidas son luego activadas, tratamiento que consiste en el uso de agentes químicos que desencadenan las divisiones celulares que inician el desarrollo embrionario. Los embriones luego de cultivados son transferidos a hembras receptoras previamente sincronizadas que llevarán a adelante el resto de la gestación.

La verificación de la presencia del transgen se realiza al nacimiento de los animales.