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Clase 3: Rhizobium (primera parte)


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Fertilizacion química o biológica

El uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ocasiona graves problemas de contaminación. No todo el fertilizante que se aplica lo aprovecha la planta sino que en una cuantía importante acaba en lagos y lagunas. La fijación biológica de nitrógeno es la opción natural de fertilización .

Los procesos naturales de fijación biológica del N2 (FBN) juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo de nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas.

Impacto ambiental de la aplicación de fertilizantes nitrogenados

La contribución de la fijación de N2 al ciclo global de este elemento no ha cambiado en los últimos años, teniendo un balance aproximado con el proceso de desnitrificación, el cual convierte el nitrógeno combinado en N2 atmosférico. En la actualidad la fijación no ocurre eficientemente debido a que es inhibida por la presencia de nitrógeno mineral en el medio.

(Vitouseck y Matson, 1993, citado en Anónimo, 2001) estiman que, alrededor del 50 % de los fertilizantes nitrogenados aplicados a los cultivos es absorbido por las plantas, el otro 50 % o más es almacenado en el suelo para la nutrición de los cultivos subsiguientes; pero una gran parte de este es transformado en N2 atmosférico mediante los procesos de desnitrificación de los microorganismos y otra gran parte es lixiviado a capas inferiores donde contaminan las aguas subterráneas y el manto freático en forma de nitratos (NO3). En Iowa el incremento del contenido de NO3 en aguas subterráneas desde 1950 a 1980 ha sido paralelo al incremento del uso de fertilizantes nitrogenados.

El óxido nitroso (N2O) es otro gran factor contaminante producto del excesivo uso de fertilizantes nitrogenados, este conjuntamente con el CO2, metano (CH4) y los clorofluorcarbonos producen el efecto invernadero causante en gran medida del calentamiento global. La energía reflectiva por mole del N2O es alrededor de 180 veces la de CO2, lo que lo convierte en un potente gas invernáculo. El N2O troposférico ha aumentado potencialmente en la década del 80, conjuntamente con el incremento sustancial de la aplicación de fertilizantes sintéticos. Por otro lado la desnitrificación del NO3 produce cerca del 90 % de N2 y 10 % de N2O, al aumentar la cantidad de nitrógeno en el suelo producto de su uso indiscriminado, aumenta este proceso de desnitrificación y por consiguiente los niveles de toxicidad en la atmósfera. Hoy día la cantidad global de este compuesto se encuentra fuera de balance, excediendo de un 30–40 %, su concentración en la atmósfera también se incrementa 0.25 % por año (Vitouseck y Matson, 1993, citado en Anónimo, 2001 a). Esto demuestra que la producción de fertilizantes nitrogenados no solamente interviene en el agotamiento de la energía natural y el combustible fósil, sino también genera grandes cantidades de CO2 en su producción y contribuye sustancialmente al calentamiento global potencial.

Según González y Lluch (1992), con la aplicación de Rhizobium en suelos con bajo contenido de nitrógeno se puede aumentar los rendimientos de plantas leguminosas. Sin embargo los inoculantes para leguminosas no se ha demostrado que sean efectivos en suelos con razas autóctonas, una limitación de este sistema es la competición. Inóculos preparados con razas muy efectivas en la fijación de N2 se ha visto que son incapaces de formar una proporción significativa de nódulos en situación de campo por la competición con las cepas autóctonas.

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El uso de los inoculantes y las técnicas de inoculación

Extractado de FAO, 1985 (bibliografía)

En muchos suelos las bacterias  provenientes de los nódulo no están en condiciones óptimas, para realizar la fijación biológica de nitrógeno en simbiosis con las leguminosas, ya sea por el número o calidad. En esas circunstancias es necesario inocular la semilla o el suelo con cultivos de rhizobios altamente efectivos.

Las bacterias del nódulo, rhizobios se cultivan en el laboratorio y se combinan con un soporte adecuado como la turba, compost, vermiculita, para preparar el inoculante. El proceso por el que se agrega este inoculante a la semilla se llama inoculación.

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Cualidades de un inoculante efectivo

  • El inoculante deberá contener solo rhizobios capaces de producir nódulos y fijar grandes cantidades de nitrógeno con los diferentes hospedantes. Los inoculantes efectivos pueden integrarse con una sola cepa de rhizobios (monocepa), o pueden contener varias (multicepa). Los inoculantes monocepas son buenos donde las  pruebas de campo han demostrado que una determinada cepa de rhizobio se comporta mejor en un hospedante específico o genotipo, en las condiciones del suelo y clima predominantes y cuando los productores siembran generalmente esa determinada variedad o genotipo de leguminosa.  Los inoculantes multicepa se prefieren en zonas donde se cultivan muchas variedades o cultivares de leguminosas y donde pueden existir grandes variaciones de suelo o clima. Los inoculantes multicepa deben ser específicos para todos los hospedantes considerados. Si no fuera así, tales cepas pueden impedir la nodulación de rhizobios efectivos.

  • Los inoculantes deben proveer grandes cantidades de rhizobios, viables, por lo menos 10.000 a 1x106 por semilla.

  • El soporte o base del inoculante debe proteger al rhizobio en el paquete y sobre la semilla. Debe ser fácil de aplicar y debe adherirse bien a la semilla.

  • El inoculante debe estar libre de otras bacterias que puedan ser perjudiciales al rhizobio o a la planta.

  • El inoculante debe estar envasado para proteger a los rhizobios hasta que sea usado por el productor. El paquete debe permitir el intercambio de gases y la retención de la humedad.

  • El paquete debe proveer instrucciones claras y una lista de especies de leguminosas que nodula efectivamente. (ver grupos de inoculación cruzada)

  • El nombre y dirección del fabricante deben estar impresos en el paquete

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Tipos de inoculante

Podemos considerar dos tipos: para aplicar a las semillas y para aplicar al suelo.

Los utilizados para las semillas son los mas comunes por su fácil aplicación. La aplicación de inoculantes directamente al suelo puede ser necesaria para obtener nodulación efectiva cuando se siembran semillas de leguminosas en suelo calientes, secos o marcadamente ácidos o bajo condiciones climáticas adversas. También cuando las semillas son tratadas con productos químicos tóxicos al rhizobio o cuando el suelo posee una elevada población de rhizobios altamente inefectivos no fijadores de nitrógeno.

Generalmente se considera que los inoculantes con soporte de turba estéril son los mas seguros. Sin embargo, también debe considerarse la calidad de la turba y la temperatura de almacenamiento.

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Control de calidad y estandares

Los rhizobios viables pueden expresarse en términos de número por gramo de inoculante o como número por semilla. En Australia y Nueva Zelandia, los inoculantes deben poseer un mínimo de 1x109 rhizobios por gramo de turba en fábrica y 1x108 por gramo de turba al vencimiento.

En Cánada, para semillas preinoculadas:

  • Semillas pequeñas, ej. trébol 1000 rhizobios por semilla
  • Semillas intermedias (Onobrychis viciifolia)10.000 rhizobios por semilla.
  • Semillas grandes (soja) 100.000 rhizobios por semilla.
Pruebas para el recuento de rhizobios viables

Las pruebas para determinar el número de rhizobios viables en inoculantes se hacen por los métodos siguientes:

1. Dilución en placas usando medios diferenciales que permiten determinar el número de rhizobios vivos. Uno de los medios mas utilizados es el medio 79 o Yeast agar mannitol. Los resultados se observan entre 4 a 7 días.

(ver parte práctica del módulo1)

2. Pruebas de nodulación: se inoculan plántulas en crecimiento, aproximadamente de 15 dias, con una serie de diluciones del inóculo, haciendo referencia a las tablas del número mas probable (NMP). El método de placas es mas rápido, que éste, pues se obtienen resultados entre 15 a 30 días. La prueba de nodulación presenta los siguientes inconvenientes: demora de cuatro a seis semanas para lograr una determinación, es decir la obtención de plantas noduladas.La calidad del inoculante, puede disminuir durante el período que insume conducir esta prueba. Los rhizobios son organismos unicelulares  morirán si la temperatura es demasiado alta o sino hay suficiente humedad.

La figura 1, muestra la supervivencia de Bradyrhizobium japonicum en un inoculante a base de turba conservada a 3 temperaturas diferentes y conservado en bolsas de polietileno.

Figura 1: efecto de la temperatura sobre la sobrevivencia.

Solamente luego del recuento de viables, se puede determinar si los rhizobios están vivos o muertos pues, un inoculante que contiene solo rhizobios muertos aparentemente se visualiza igual a otro con rhizobios vivos. Además, algunos rhizobios vivos no son capaces de producir nódulos. Es por lo tanto necesario no sólo determinar el número de rhizobios vivos sino además la habilidad de producir nódulos efectivos en el hospedante específico. Lo cual requiere un tiempo considerable.

Requerimientos de identificación

La información requerida debe constar en el envase, esta incluye:

  • Nombre de la leguminosas para la que el inoculante es efectivo (nombre común y científico).
  • Nombre científico de las especies de rhizobios, que contiene el inoculante.
  • Número de rhizobios viables por gramo de soporte o número de rhizobios viables por semilla que el producto provee cuando se usa según las directivas especificadas, al momento del vencimiento.
  • Fecha de vencimiento, luego del cual, no puede considerarse seguro.
  • Número de lote para el control de calidad.
  • Instrucciones de uso.
  • Peso neto del inoculante.
  • Marca comercial, fabricante y dirección.
  • Condiciones de almacenamiento requeridas, recordar que es un producto perecedero.

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Almacenamiento y vigencia

Los inoculantes para leguminosas son perecederos y pueden perder efectividad al ser expuestos a temperaturas de 40 0C o mayores por unas pocas horas. Los inoculantes de alta calidad deberían retener su efectividad durante 6 meses o mas cuando se almacenan a 20 0C aproximadamente. Este período puede extenderse si el inoculante es refrigerado a 4 oC aproximadamente. Debería alertarse sobre el efecto perjudicial de las altas temperaturas en los inoculantes. También es perjudicial el congelamiento pues puede dañar las membranas de las células de rhizobios.

Sugerencias para comprar y almacenar inoculantes

Diferentes leguminosas requieren diferentes inoculantes. Asegúrese de elegir el correcto. El inoculante debe ser fresco. Observar la fecha de expiración después de la cual, el inoculante no da seguridad de producir resultados satisfactorios. Mantener el inoculante en lugar fresco hasta su uso. El frío no perjudica a las bacterias, aunque éstas no pueden tolerar altas temperaturas. Es mejor inocular las semillas justo antes de la siembra. Los rhizobios en la semilla mueren rápidamente, pues allí le faltan los nutrientes necesarios para su desarrollo, además de faltarle humedad. Utilizar semillas de alta calidad. Sembrar sobre tierra bien preparada. En el proceso de inoculación, evitar dejar las semillas demasiado húmedas. Usar sólo el agua necesaria para lograr buena adherencia del inoculante a la semilla.

Los productos químicos (fungicidas o insecticidas) agregados en la semilla o aplicados al suelo pueden ser tóxicos para la bacteria del nódulo. Si las semillas están químicamente tratadas, usar mayor cantidad de inoculante y sembrar inmediatamente después de la inoculación.

Almacenar la semilla inoculada en lugar fresco y protegido hasta la siembra. Mantenerla alejada del calor solar y protegerla de la desecación. El inoculante sobrante puede permanecer en el envase siempre que se cierre de tal forma de prever excesivo secado. El inoculante sobrante almacenado en refrigeración a 40C permanecerá efectivo durante varios meses. Los nódulos deben desarrollarse sobre las raíces de las leguminosas en tres o cuatro semanas. Cuando se examina la nodulación utilizar una pala común o de dientes para extraer las plantas; si las plantas se arrancan los nódulos pueden separarse de las raíces. Observar en que raíces se forman.  Se prefiere en la raíz principal a las raíces secundarias. Los primeros indican una nodulación temprana. El inoculante sobrante no debe ingerirse ni ser usado para la alimentación animal.

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Determinación de la necesidad de inoculación

Eta técnica es necesaria cuando se introducen cultivos de leguminosas en regiones nuevas. Con frecuencia se desarrollan cepas específicas de rhizobios para los nuevos cultivares o variedades de leguminosa y es una práctica beneficiosas utilizarlas.s.

En el suelo podemos tener cepas naturalizadas inefectivos capaces de inducir nodulación sin beneficio para la planta hospedante, las cuales pueden haberse adaptado a condiciones adversas, altas temperaturas, heladas, desecación de suelo, es decir son mas competitivas pero no efectivas. Esta última característica fue comprobada.

Por otra parte las cepas introducidas en el inoculante se ensayaron en las condiciones optimas para crecer en laboratorio y podrían ser menos competitivas y mas susceptibles al estrés. Estas últimas fueron seleccionadas por la capacidad de fijar nitrógeno. Los inconvenientes anteriores se solucionan con alta concentración del inóculo.

Como conclusión podemos decir que incluso en lotes con historia de soja, que tendrían cepas del los rhizobios específicos  aunque naturalizados, con las características antes mencionadas, es conveniente inocular las semillas.

Pruebas de campo

Cuando  se desconoce si  el suelo tiene rhizobios específicos infectivos y efectivos, se recomienda una prueba de campo para determinar la necesidad de inoculación. Se requieren tres tratamientos básicos:

  • Plantas obtenidas de semillas inoculadas con el mejor inoculante disponible.
  • Plantas no inoculadas sin tratamiento de fertilización.
  • Plantas no inoculadas, fertilizadas con nitrógeno (sirven como prueba de las condiciones de crecimiento).

Siempre que sea posible, los tres tratamientos deberían hacerse en dos niveles de fertilidad: el que será usado por el productor y el nivel óptimo desde el punto de vista económico.

Se recomiendan cuatro repeticiones por tratamiento con parcelas sorteadas al azar. Debe hacerse un diseño estadístico ver Vincent,1975.

Resultados e interpretación

A continuación se detallan las explicaciones (E), para diferentes situaciones (S), que pueden desarrollarse en ensayos de campo.

Figura 2: diagnóstico de la nodulación  y eficiencia de la fijación de dinitrógeno.

Plantas no inoculadas

(S) No existen nódulos en los controles sin inocular. Plantas amarillas.

(E) No existen rhizobios nativos capaces de infectar esa leguminosas.

Plantas inoculadas

(S) Las plantas inoculadas tienen nódulos grandes e internamente rojos. Las plantas son de color verde intenso. El control sin inocular tiene nódulos pequeños o no tiene nódulos y las plantas son amarillas.

(E) rhizobios nativos inefectivos. Inoculante altamente efectivo.
Plantas no inoculadas

(S) Muchos nódulos pequeños distribuidos en el sistema radicular. Plantas amarillas

(E) Los rhizobios nativos son inefectivos para la fijación de nitrógeno

Plantas no inoculadas

(S) No existen nódulos en los controles sin inocular. Plantas verdes.

(E) Suelo con alto contenido de nitrógeno mineral. No existen rhizobios nativos capaces de nodular esa leguminosas.

Plantas inoculadas

(S) Las plantas inoculadas no tienen nódulos. Plantas amarillas.

(E) El inoculo no es apropiado o los rhizobios en el inóculo están muertos.
Plantas no inoculadas

(S) Suelos con nódulos grandes, con el interior rojo, en los controles sin inocular. Plantas de color verde intenso.

(E) Rhizobios nativos efectivos. No requiere inoculación.
Plantas inoculadas

(S) control con nitrógeno nodulado,  nódulos pequeños, plantas verdes.

(E) rhizobios inefectivos. Los nódulos no son funcionales debido al nivel de nitrógeno.

Plantas no inoculadas

(S) Nódulos pequeños en los controles sin inocular. Plantas verde intenso.

(E) Suelo con alto contenido de nitrógeno. Los rhizobios nativos pueden ser efectivos o inefectivos.

Referencia: Adaptado de Singleton, NifTAL.2003.

Plantas inoculadas

(S) Plantas inoculadas fertilizadas con fósforo y potasio, mas grandes y vigorosas que las inoculadas no fertilizadas.

(E) suelo con bajo contenido de fósforo y potasio. Requiere fertilización para máxima fijación de nitrógeno.

Estas distintas situaciones deben ser tenidas en cuenta para conocer si es necesaria la inoculación y si debe agregarse además del inóculo un fertilizante.

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Métodos de inoculación

Para fabricar un inoculante, los cultivos de rhizobios preparados en el laboratorio se mezclan con varios tipos de inertes sólidos finamente pulverizados, como turba, compost residuos de la industria azucarera, bagazo o algún otro soporte apropiado. Esta formulación se aplica normalmente a la semilla de leguminosa antes de la siembra para asegurarse que desarrollaran nódulos efectivos y que las plantas tendrán suministro seguro de nitrógeno. Un método alternativo es aplicar el inoculante directamente al suelo. Esto es necesario bajo algunas condiciones, aunque puede ser de mayor costo.

Con semillas las dosis de inoculante recomendadas por los fabricantes varían de 4 a 6 gramos por kg de semilla ó 0,28 a 0,42 kg.  por ha. Para densidades normales de siembra de caupí o soja. En comparación se requieren de 6 a 8 kg de inoculante granular por ha. de tierra.

1. Inoculación de la semilla

Tipos de inoculantes para semillas

Los tipos de inoculantes corrientemente disponibles son:

  • En botellas, con agar inclinado.
  • En turba, compost, carbón, vermiculita y otros soporte sólidos finamente molidos y húmedos.
  • Caldos o cultivos líquidos.
  • Formulaciones liofilizadas o congeladas.
  • Caldos concentrados congelados.
  • Formulaciones desecadas en aceites sobre talco o vermiculita.
  • Rhizobios incluidos en poliacrilamidas, alginatos o xantinas.

Fouilleux et al.1996 Desarrollaron  un método para agregar pequeñas cantidades de sustrato carbonado junto a la formulación del inoculante. Para ello utilizaron carrier granulados, microgránulos minerales (bentonita, ilita, silicatos) con agregado de nutrientes e inoculados con B. japonicum sobre soporte de turba o liquido. Se logró  incrementar el crecimiento de los rhizobios, dentro del rango de 1 orden de magnitud por g o ml de inoculante, en suelos no esterilizados. Esta técnica produce una nodulación mas temprana y aumentos de N en grano.

En la preparación del inoculante se emplea un promedio de 10 kg de gránulos que contienen un agregado de 1.14 kg de glicerol y 0.16 kg de Na glutamato  por ha.

Métodos de aplicación de inoculantes para semillas.

Aplicación en húmedo: el inoculante se mezcla primero con el agua para formar una suspensión uniforme y fluida. A veces se le agrega al agua goma arábiga o azúcar para aumentar la adhesividad del inoculante a la semilla. El uso de azúcar en la suspensión decrece la mortandad de rhizobios durante la desecación de la semilla.

La cantidad de agua necesaria en la suspensión varía en función del tamaño de la semilla. Se requiere mas agua para las semillas pequeñas que para las grandes debido a la mayor superficie a cubrir. Es muy importante no humedecer demasiado la semilla, ya que se pueden formar grumos o sufrir daños al pasar por el mecanismo de distribución. Deben quedar recubiertas uniformemente. Este método da buen resultado, aunque debe esperarse a que la semilla se seque. Las condiciones de secado deben realizarse protegidas del sol.

Figura 3: Arriba: semillas de soja (Glycine max) con inoculación en húmedo. Abajo: sin inocular

 Referencia FAO,1985

A continuación se detallan las cantidades a usar para inocular distintas leguminosas.

Tabla 1: Cantidades de inoculante y agua requeridas para inocular semillas de leguminosas de varios tamaños por el método húmedo.

Especies de leguminosas

Semillas

Inoculante

Agua

Suspensión

 

(Número.kg)

(g.25 kg
de semilla)

(ml.25 kg
de semilla)

(ml.25 kg
de semilla)
Trifolium repens (trébol blanco)

2x106

110

625

750

Medicago sativa (alfalfa)

5x105

110

550

650

Coronilla varia

25x104

110

550

650

Vigna radiata

25x103

110

500

550

Vigna unguiculata (caupí)

10x103

110

375

437

Glycine max (soja)

5x103

110

250

287

Cicer arietinum (garbanzo)

2x103

110

250

287

Vicia faba (haba)

1250

110

175

200

Referencia: FAO,1985

Las leguminosas se ordenan en orden ascendente de tamaño.

Método semihúmedo: se humedece la semilla con agua azucarada y posteriormente espolvorear con el inoculante.

Método seco, cajón sembrador. En este método, el inoculante en polvo se mezcla directamente con la semilla sin usar agua o líquido. Debido a que el inoculante seco no se adhiere bien y se pierde, por ello no es recomendable. Además puede haber una mala distribución del inoculante quedando  parte en la tolva. Solamente es conveniente por la sencillez y rapidez.

Peleteado con carbonato de Ca. Los rhizobios en la semilla inoculada mueren al colocar la semilla en suelos muy ácidos o al mezclar con fertilizantes ácidos antes de la siembra. Para evitar estos inconvenientes se recubren con carbonato de calcio. Primero se inoculan en húmedo, con  el inoculante sobre soporte de turba. Posteriormente se mezcla rápidamente haciéndolas rodar hasta que queden recubiertas por el carbonato de calcio.

Para climas tropicales se reemplaza el carbonato de Ca por fosfato de roca pues el carbonato de Ca., puede perjudicar a las cepas ácido tolerantes. Estas sustancias permiten el secado de las semillas y evitan los grumos.

Además debería usarse un adherente que puede ser goma arábiga o una goma celulósica sintética. para pegar el carbonato a las semillas. La goma usada, debe fluir fácilmente y ser de moderada viscosidad. 

La tabla 2 presenta la cantidad de inoculante, agua, suspensión inoculante y carbonato de calcio que se requiere para diferentes semillas de leguminosas.

Cuando se peletean semillas de leguminosas con carbonato de calcio, fosfato de roca o inoculante a base de turba, se emplean gomas solubles en agua. Con gomas de origen vegetal, los materiales de peleteo tienden a desprenderse, particularmente cuando las semillas se inoculan con varias semanas de anticipación. Para solucionar esto, se utilizan varios adhesivos insolubles en agua como polivinil acetato, polivinil alcohol, barnices, resinas que se disuelven en solventes para adherir las diversas sustancias- carbón, arcilla, tierra de diatomeas talco etc.- a la semilla. También pueden incluirse en la mezcla inoculante a base de turba, productos químicos y nutrientes. El recubrimiento de la semilla es realizado generalmente por empresas especializadas con antelación a la venta. Normalmente no es práctico realizar el recubrimiento de las semillas en el propio establecimiento.

Algunas de las ventajas enunciadas para la semilla recubierta son: mayor uniformidad y facilidad de siembra, mejor germinación, plántulas mas fuertes y sanas, nodulación temprana, mejor asimilación de nutrientes. Sin embargo no ha sido probado el efecto beneficioso de las sustancias de recubrimiento. Es más, adhesivos basados en solventes son a menudo tóxicos al rhizobio. Con un inoculante a base de turba concentrado, algunos rhizobios pueden sobrevivir unas pocas semanas, pero la probabilidad de nodulación efectiva en la mayoría de las condiciones de campo es baja.

Existen algunas desventajas del peleteado: el peso de las semillas se incrementa sustancialmente, las semillas peleteadas son muy abrasivas pudiendo dañar los distribuidores y se requiere maquinaria especial. También es difícil recubrirlas completamente. La proporción semilla/ carbonato de calcio puede variar ampliamente y traducirse en densidades de siembra irregulares.

Peleteado con inoculante. Cuando se requiere un inóculo muy abundante de rhizobios puede usarse otro sistema. Se usa un tercio del inoculante (4g/kg de semilla), se aplica a la semilla suspendida en una solución de goma arábiga. Los dos tercios restantes del inoculante (8,5 g / kg de semilla) se mezclan inmediatamente con la semilla húmeda. En este sistema de inoculación ha sido muy satisfactorio para semillas sembradas en suelos calientes, secos, o donde los suelos están altamente infectados con rhizobios nativos inefectivos.

Semilla preinoculada: La semilla preinoculada se inocula antes de su comercialización. La inoculación es realizada normalmente por compañías especializadas con meses de anticipación a la siembra. Si bien la idea ha resultado atractiva para los agricultores, los resultados han sido muy desalentadores. La semilla de leguminosa no provee un buen ambiente para el rhizobio, el ritmo de mortandad es rápido. La aplicación de un inoculante a base de turba como recubrimiento con gomas y azucares permite mejor supervivencia que otros sistemas, pero los resultados con semilla preinoculada no han sido seguros.

Semilla reinoculada: la sobrevivencia de rhizobio es menor sobre la semilla que en el  inoculante, es decir que luego de peletear la población de rhizobios desciende rápido y cuando ocurre un retraso en la siembre se aconseja reinocular. En estas condiciones se agrega como adherente aceite mineral, vaselina, 1 a 1.5 l por cada 25 kg de semilla y además 200g de inoculante.

Tabla 2: Cantidades de inoculante, agua, suspensión inoculante y carbonato de calcio pulverizado requeridas para peletear semillas de leguminosas de distintos tamaños.

Especies de leguminosas

    Semillas

   Agua

Suspensión

Carbonato de calcio

 

(Número. kg)

(ml.25 kd
de semilla)

(ml.25 kg
de semilla)

(ml/25 kg de semilla

Trifolium repens (trébol blanco)

2sx106

1050

1175

10

Medicago sativa (alfalfa)

5x105

1050

1175

10

Coronilla varia

25x104

1050

1175

10

Vigna radiata

25x103

950

1000

8,7

Vigna unguiculata (caupí)

10x103

425

500

5

Glycine max (soja)

5x103

425

500

5

Cicer arietinum (garbanzo)

2x103

400

475

5

Vicia faba (haba)

1250

375

425

5


Referencia FAO,1985

Inoculantes líquidos: deben ser estrictamente controlados, ya que la mortandad puede ser mas elevada que en los que usan como soporte turba estéril. La turba es muy rica en nutrientes y con gran capacidad de retención de humedad.

La tecnología actual permitió mejorar a los  inoculantes líquidos.

Actualmente se han realizado estudios que demuestran que los dos tipos son comparables

Una diferencia entre ellos radica en que el uso de turba necesita adhesivo para  fijar la semilla, estos adhesivos se agregan junto al inoculante. Los líquidos no requieren del adhesivo.

Incorporación de curasemillas: estos protegen a las semillas y plántulas de los patógenos. Al aplicarse a la semilla estarán en contacto con los rhizobios en el momento de la inoculación. Por lo tanto los formulados, principios activos y excipientes, deben ser inocuos para las bacterias.

Momento de la inoculación: para los inoculantes por el método seco es conveniente descartarlos. Los pulverulentos pueden sembrase hasta 4 horas luego de la preparación  en cambio para los líquidos la siembra debe ser inmediata

2. Inoculación del suelo

Cuando es necesario?

Los inoculantes para el suelo son los diseñados para ser aplicados directamente al suelo en lugar de a la semilla, este tipo de inoculación se recomienda en las siguientes condiciones:

  • Cuando las semillas de leguminosas están recubiertas con sustancias químicas atóxicas para protegerlas contra hongos, insectos y otras plagas del suelo, y los rhizobios aplicados a las semillas podrían morir.
  • Cuando se siembra en suelos calientes o secos,  su uso es inevitable. La ubicación de los rhizobios en suelo húmedo debajo de la semilla puede dar como resultado una buena supervivencia y efectiva nodulación.
  • Cuando los suelos están infectados con poblaciones altas de cepas inefectivas no fijadores de nitrógeno. Los inoculantes de suelo pueden introducir un inóculo mayor de rhizobios efectivos que el que puede aplicarse directamente a la semilla.
  • Cuando se obtiene buena densidad inicial de plantas y por alguna razón fallan en producir nódulos.

Los inoculantes para el suelo pueden ser introducidos en surcos en el terreno después de la siembra usando sembradores tipo zapata, o distribuidos en cobertura, o pulverizados sobre el suelo antes de una lluvia o riego. Esta práctica de inoculación de emergencia puede inducir nodulación efectiva y salvar el cultivo.

Tipos de inoculantes para el suelo

Los tipos de inoculantes de suelo varían ampliamente, según el método de aplicación usado. Los diferentes tipos son: líquidos o congelados concentrados.

En los Países Bajos se han distribuido con éxito durante muchos años, usando sistemas de goteo o pulverización. Se obtuvo nodulación efectiva de soja en Senegal, aplicando 5 litros de suspensión inoculante 2/3 de turba, 1/3 de agua por ha.

En la Argentina están difundidos, en el ámbito comercial los inoculantes para aplicar a las semillas, formulados sobre soporte pulvurulento: turba estéril y no estéril, dolomita, vermiculita o soporte liquido: acuosos estériles, oleosos no estériles que incluyen un fungicida.

Direcciones de fabricantes comerciales de inoculantes:

[temario]

Efecto de la inoculación sobre el rendimiento.

1. Inoculación en maní

Tabla 3: Inoculación de maní en Trinidad

Tratamientos

Soporte vermiculita
Peso parte aérea

(g).

estéril
Peso de nódulos (mg)

Cultivo a campo
Rendimiento
( kg.ha-1)

testigo

1.66

0

511

Cepas :

AH 10

CB 756

SO18S

AH 6K

22 BK

 

2.49

2.19

2.35

2.64

2.82

 

53.8

25.2

37.6

33

30.5

 

527

641

756

838

929

Graham and Donowa*1982

2. Inoculación en poroto

Martínez-Viera (1986), reporta que la respuesta a la inoculación del poroto en condiciones de campo es variable, y son frecuentes las respuestas negativas. En trabajos realizados se han obtenido aumentos en los rendimientos hasta de 98.6 % con tres cepas de seis probadas. El crecimiento de las plantas fue similar al de lotes que recibieron 50 t de N ha-1, mientras los lotes no inoculados mostraron síntomas claros de deficiencia. En lo que respecta a la fijación, se han reportado cantidades de reducción del acetileno en las plantas hasta de 30 mol C2 H4 h-1 considerándose comunes en las simbiosis efectivas cantidades superiores a 20 mol. A pesar de estos resultados que indican una elevada efectividad de la simbiosis se han reportado notables porcentajes de plantas noduladas sin inoculación en distintas regiones, tales como en el Medio Oeste de Estados Unidos, al igual que en Río Grande do Sul y Sao Paulo (Brasil), principalmente en cultivos comerciales de poroto (Phaseolus vulgaris). En Cuba el porcentaje de plantas no inoculadas con nódulos ha oscilado entre 15 y 25 %. Esta nodulación natural no significa efectividad en la fijación, como lo indica el hecho  que en una evaluación de 85 cepas aisladas de nódulos formados naturalmente en plantas de poroto, solo 14 % fueron eficientes, 69 % moderadamente eficientes y 17 % ineficientes.

Coinoculación en poroto

  • Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum

    Hasta el momento, el poroto común (P. vulgaris) es considerado la leguminosa de más baja capacidad de fijación de N2, debido a la lenta formación de nódulos radicales por Rhizobium, lo cual contribuye a la poca cantidad de N2 fijado para los requerimientos nutricionales de la planta (Burdman et al., 2000). Según estos autores cuando esta leguminosa es inoculada con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum brasilense, el número total de nódulos y la fijación de N2 se incrementa significativamente en comparación con plantas inoculadas con Rhizobium solo. El crecimiento de las plantas es acelerado por la actividad estimuladora de Azospirillum, promoviendo la formación de pelos radicales y el incremento de la secreción de genes de nodulación (nod), induciendo flavonoides en los exudados radicales. La excreción de estas sustancias son necesarios para la posterior infección por Rhizobium. De este modo la inoculación combinada de Rhizobium y Azospirillum incrementa los rendimientos de las leguminosas bajo condiciones limitadas de agua y nitrógeno.

  • Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azotobacter

    El género Azotobacter tiene la capacidad de producir fitohormonas y vitaminas, tales como, ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas , tiamina, ácido pantoténico, ácido nicotínico y biotina, las cuales intervienen directamente en el desarrollo vegetal y trae consigo un alargamiento y acondicionamiento de la raíz para facilitar la infección por Rhizobium y la posterior nodulación (González y Lluch, 1992; Rodelas, 2001).

    Además de estas sustancias, el género Azotobacter es capaz de solubilizar fosfatos, haciéndolos asimilables tanto para las plantas como para los microorganismos rizosféricos, y de este modo contribuyen a crear las condiciones favorables para una buena nodulación por Rhizobium. Las condiciones de baja disponibilidad de fósforo reduce la fijación del N2 por efectos específicos en la iniciación y crecimiento del nódulo y la actividad nitrogenasa (González y Lluch, 1992; Montes, 1999

Arcocha et al. (1994) señala que la respuesta del cultivo del poroto a la inoculación con cepas comerciales de rhizobios ha sido inconsistente, por lo cual se hace necesaria la evaluación de nuevas cepas, además de evaluar el efecto de la fertilización inorgánica con fósforo (P) sobre estas. En estudios realizados sobre la inoculación de cepas de rhizobios contra fertilización química en poroto, demostraron que al evaluar 7 cepas experimentales de biofertilizantes Mexicanos y una comercial (Nitrobiol) bajo una dosis constante de P (40 kg. ha-1), incluyendo 3 tratamientos adicionales resultantes de la combinación de 60 kg. ha-1 de N y 40 kg. ha-1 de P, más un testigo, obtuvieron una respuesta positiva con el uso de este biofertilizante. Las variables medidas fueron: rendimiento de frutos, peso de nódulos, número de nódulos, peso del follaje y peso de la raíz. Los rendimientos obtenidos con la cepa más sobresaliente (FM 110 + P) fueron similares a los obtenidos con el tratamiento de fertilizante químico (60-40-00). Sin embargo las utilidades fueron ligeramente mayores con las cepas de Rhizobium. El efecto de las cepas analizadas se reflejó en un incremento de 2460 kg. ha-1 de fruto en relación con los tratamientos de fertilizantes 00-40-00 y 00-00-00, y un incremento de 4478 kg. ha-1 de frutos en relación al tratamiento 60-00-00.

[temario]


Técnica de preparación de un inoculante en pequeña escala

En base a que características se seleccionan las cepas?

Deben elegirse cepas infectivas, especificas y efectivas además deben competir con las nativas o naturalizadas además seleccionadas para las condiciones climáticas de la zona en que desarrollaran las plantas.

Por los factores anteriormente mencionados es indispensable realizar ensayos en un principio en invernáculo y finalmente a campo en las mismas condiciones en que se usara el inoculante.

En el país existe una gran experiencia en el tema. El IMYZA (INTA CASTELAR)dispone de una selección de 150 cepas de B. japonicum evaluadas por su eficiencia para distintas condiciones de suelo, clima y variedad. Ellos realizan ensayos en invernáculo y las de mayor eficiencia se prueban a campo. La selección se hace para distintas regiones, considerando los parámetros de nodulación, rendimiento en grano ( kg.ha), proteína en grano, proteína total y N en los restos de cosecha. De estos ensayos surge las recomendaciones de cepas altamente eficientes para se empleadas por los fabricantes de inoculantes nacionales e incluso de otros países.

El primer paso consiste en el desarrollo del rhizobio en pequeñas escala, para posteriormente inocular el fermentador

Modo operatorio

1.Preparación del material

Medio de cultivo para mantener la cepa viable: Preparación de 500 ml de medio Wasksman 79 = Y.E.M.( yeast extract medium) y esterilizar a 1200 C 20 minutos.

Colocación del medio de cultivo en el Erlenmeyer de 1 L. con una barra imantada, para asegurar la agitación del medio, cerrar con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio.

2. Selección de cepas de rhizobios en base a las características citadas con anterioridad.

3. Siembra del cultivo

Se inocula con una suspensión de microorganismos desarrollada en tubo en estría.

Luego de inocular el Erlenmeyer ubicar en el agitador magnético y mantener a 300 C

4. Controlar la viabilidad y pureza de los rhizobios

En esta etapa se preparan cajas de Petri para el recuento de microorganismo,s también se realiza la determinación de Gram, para determinar pureza de la cepa.

5. Siembra en el fermentador

Para inocular un fermentador se necesita utilizar un precultivo que representa el 2% del volumen a inocular, ej. 500 ml para un fermentador de 25 L de un volumen útil.

Fermentador (aparato destinado a la multiplicación de Rhízobium en medio liquido).

Consta de una cuba de acero con capacidad de 20 L con los accesorios que permiten inocular, agitar, tomar muestras.

  1. El medío de cultívo se prepara directamente en la cuba antes de esterilizar.
  2. Esterilización: el aparato con sus accesorios puede esterilizarse en autoclave durante 1 hora a 120 OC.
  3. Puesta en uso: luego de esterilizar y enfriar se inocula con un cultivo desarrollado en 500 ml de medio de cultivo y poner en funcionamiento.
  4. Seguimiento del cultivo: se pueden extraer muestras durante la incubación con el objeto de determinar la curva de crecimiento de rhizobios en base al número o densidad óptica.
  5. Cosecha de rhizobios: al obtener 109 células de rhizobios por ml.

Figura 4: Curva de crecimiento de rhizobios, de desarrollo rápido y lento.

____________________

Figura 5:
Esquema de un fermentador

1: Tubo para la entrada de aire, 2: filtro de acero inoxidable, 3: Tubo para la salida de aire, 4: Sonda para inocular y tomar la muestra, 5: Tapa con aberturas, 6: Manija para transporte, 7: Cuba de acero inoxidable.

Preparación de soportes para inocular

El inoculante  para una leguminosa se compone de 2 partes:

  1. El rhizobio  especifico de la leguminosa.
  2. El soporte, sólido o líquido constituido por distintas formulaciones: inoculante en polvo, granular, líquido.

Características del soporte, turba.

El soporte a utilizar debe molerse muy fino (100 m)  y no debe ser muy ácido.  En general se utiliza turba tamponada de pH cercana a 6.

Determinar la cantidad de cultivo Líquido, "retenido "por el soporte. Pesar 50 gm de turba, agregar 1 00 ml de agua destilada agitar unos minutos para homogeneizar el conjunto filtrar por un embudo recubierto con papel de filtro recoger en una probeta graduada y medir el volumen del liquido luego de la filtración.

% de retención de agua = 50 ml – vol ( ml de agua percolada) X 2

Por ello la cantidad de cultivo inyectado  en los sachets debe ser el 60%-70 % de la capacidad  máxima de retención.

Tabla 4: Efecto de la esterilización de la turba sobre la sobrevivencia de rhizobios* ( X106.g) luego de 4 y 26 semanas

cultivo
4 semanas
26 semanas
  
R. leguminosarum bv trifolii
R. meliloti SU47
Bradyrhizobium CB 756
A* B* C*
660 990 110
1500 1800 697
1100 1200 16
A B C
6 79 2.8
180 170 5.3
25 190 1

A: esterilización en autoclave, B: esterilización por rayos gamma, C: turba no estéril

Referencia Vincent,1974

La esterilización de la turba permite extender el periodo de vencimiento del inoculante.

Preparación de los sachets

El peso de los sachets estará en función de la superficie a inocular.  Los sachets son de polipropileno autoclavable a 120 0C

  • Preparar sachets con 50 g de turba.
  • Soldar con precaución la abertura.
  • Esterilizar dentro de una caja metálica por thindalización.

Envase

La mayoría de los fabricantes de inoculantes para leguminosas utilizan un envase de material flexible tal como el polietileno, que retiene la humedad y permite el  intercambio de gases. Los materiales que no permiten la difusión del oxígeno y el anhídrido carbónico no son apropiados. El espesor del material puede variar entre 0.027 y 0.076 milímetros, para proveer adecuada resistencia y soportar las condiciones de embarque. Si la contaminación no es un problema y se practican poros de respiración, puede utilizarse polietileno de alta densidad.

Inoculación de sachets

Para inocular se usa el cultivo proveniente de los fermentadores, este cultivo debe contener de 5 x 108 a 20 x 10 8 microorganismos por ml.

Recordar que el tiempo de generación de Rhizobium de crecimiento rápido es de 3   horas y de Bradyrhizobium (crecimiento lento) es de 10 horas

  • La inoculación se efectúa en condiciones de esterilidad, se agrega con una jeringa estéril.
  • Luego de la inoculación cerrar el orificio, por donde se inoculó, con cinta adhesiva.
  • Homogeneizar el conjunto turba mas inóculo.
  • Identificar el sachet: con la fecha de fabricación, el nombre de la cepa, su especificidad y el peso del inóculo.

Maduración: finalizada la inoculación se puede mantener a temperatura ambiente durante una semana para permitir la maduración del inóculo. En este momento es importante determinar las condiciones de sobrevivencia de los rhizobios para determinar la fecha de vencimiento.  Posteriormente almacenar a 5 0C

Luego de fabricado deben realizarse ensayos de invernáculo y de campo

Aplicaciones

volumen útil de la cuba
 inóculo 2% 

semilla peleteada
Ha
suelo inoculado
Ha
15 L 90 22
25 L 150 30
50 L 300 75

Tabla 5: Comparación de distintos métodos para la aplicación de inoculantes a las semillas

Método de inoculación

Ventajas

Inconvenientes

LIQUIDO

No se necesita equipo, buena supervivencia, no necesita adhesivo.

Incompatibilidad con agroquímicos, menor supervivencia.

Debe existir coordinación entre laboratorio y campo.

Monocepa

Gran especificidad.

   

Multicepa

Permite inocular distintos cultivos (Ej. alfalfa y trébol)

Distintas cepas pueden tener distinto predominio.

TURBA

Facilidad de realización, buena supervivencia.

Mas dificultoso que el inóculo líquido.

Soporte estéril

Número elevado de rhizobios.

Difícil fabricación

Soporte no estéril

Simplicidad de fabricación

Menor supervivencia

presencia de patógenos.

GRANULADO

Buena supervivencia, compatibilidad con agroquímicos

Elevado costo de producción

PELLETEADO

Mayor protección del inóculo, mejora la nodulación, aumenta la supervivencia

Preparación mas delicada

PREINOCULACIÓN

muy sencillo

Mortalidad elevada

 

[temario]


Control de la calidad de inoculantes sobre soporte esteril

Objetivos de los métodos de control

  1. Comprobar que la semilla tiene un número suficiente de rhizobios efectivos.
  2. Comprobar la sobrevivencia de la bacteria en el soporte.

La cantidad de microorganismos contenidos en el inoculante es fundamental y ello es uno de los factores que condiciona el éxito de la inoculación.

Un inoculante debe proveer a la semilla un número máximo de células viables de una cepa seleccionada y específica de rhizobios. El inoculante de alta calidad debe estar libre de contaminantes y poseer un alto número de rhizobios capaces de nodular rápidamente en el cultivo inoculado además de permitir que el 100% de las plantas nodulen antes de los primeros diez días de emergencia de las plántulas de soja.

En 1994, a través de la Resolución 310. se designa como ente fiscalizador al Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria (SENASA) y se establecieron las características que deben reunir los fertilizantes biológicos, incluyendo los inoculantes para leguminosas

Todos los productores de inoculantes deben inscribirse en el SENASA debiendo constar el número de inscripción en el marbete del producto, como así también la dosis, fecha de vencimiento.

Esta institución tiene poder legal, incluso, para suspender la venta de productos no autorizados. Estableció los siguientes límites:

Dosis de inoculación

  • Semilla grande 200 gm de inoculante, deben mezclarse con 25 kg de semilla.
  • Semilla pequeña 200 gm de inoculante, deben mezclarse con 50 kg de semilla.

La concentración estándar exigida debe alcanzar en el recuento en semillas sobre soporte sólido estéril o semilla preinoculada al vencimiento:

  • Un mínimo de 200 rhizobios por semilla pequeña
  • Un mínimo de 80X103 rhizobios por semilla grande

El recuento en semillas sobre soporte líquido debe llegar a :

  • 103   rhizobios /semilla pequeña
  • 105   rhizobios /semilla grande

Recuento en soporte turba para semilla grande y pequeña, soporte no estéril.

  • Para soporte recién inoculado al momento de la elaboración debe contener 109 bacterias específicas por gm de soporte.
  • Al momento del vencimiento debe contener 108 bacterias específicas por gm de soporte.

I. Materiales utilizados para realizar el recuento de rhizobios viables de un inoculante

  • Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 100 ml de agua destilada
  • 10 tubos con 9 ml de agua estéril
  • 15 tubos con YEM agar (15 ml)
  • 15 cajas de Petri estériles
  • 1 agitador magnético
  • 1 agitador para tubos (Vortex)
  • 1 baño  maría
  • 10 pipetas de 1 ml
  • 2 pipetas de 5 ml
  • 10 gm de inoculante

Modo operatorio

  • Fundir el medio YEM  en baño maría posteriormente  cuando el agar esta fundido colocar el  medio en las cajas estériles.
  • Pesar 10 g de inoculante en 100 ml. de agua estéril, agitar durante 15 minutos.
  • Preparar las diluciones ( -1) a ( -9) en agua estéril antes de tomar la muestra homogeneizar la  suspensión.

Realización de las cajas de recuento con medio Y.E.M.

Cuando se finalizó la preparación de las diluciones sembrar las cajas con medio YEM en superficie, con espátula de Drigalsky e identificar las cajas:

  1. Colocar 1 ml de las diluciones ( -9, -8, -7,-6,-5,-4,-3 )  y distribuir con la espátula, es decir comenzar por la mayor dilución
  2. Colocar en estufa a 28º C hasta que se formen colonias, 3-4 días.

Recuento

  • Las colonias típicas son blancas, de aspecto mucoso, 1-2 mm de diámetro, los contaminantes se tiñen de rojo.
  • Se contarán las cajas que tengan entre 30  a 300 colonias.
  • El número de colonias se multiplica por la dilución.
  • Medio de cultivo
  • Recuento en cajas
DILUCIÓN RECUENTO (ufc) Número de rhizobios X g. de turba
10-4    
10-5    
10-6    
10-7    
10-8    
10-9    
promedio    

Interpretación de los resultados:

número de rhizobios por g de inóculo =

Número de colonias x inversa de la dilución x volumen de H20

g de turba

RECUENTO DE RHIZOBIUM INFECTIVOS Y EFECTIVOS DESARROLLADOS SOBRE EL SOPORTE DE TURBA

Método de recuento en planta (método indirecto) por la técnica de número más  probable (NMP)      

Se inoculan plantas con las diluciones  adecuadas (10-1 a 10-6) del inoculante y luego de 3-4 semanas se observa la formación de nódulos. En los tubos con nódulos  se interpretan los resultados en base a las tablas de Brockwell, 1963

Técnica:

  • Esterilizar las semillas con H2O2 al 30% v/v
  • Lavarlas con agua estéril, realizar 3 lavados.
  • Colocar  las semillas a germinar en cajas de Petri estériles y humedecidas con agua estéril.
  • Dejar desarrollar las plántulas hasta la formación de los cotiledones
  • Repicar a frasco con solución nutritiva con nitrógeno y dejar desarrollar las plantas durante una semana.(Solución Hoagland modificada, ver T.P.1)
  • Trasplantar una plántula por tubo
  • Preparación de las diluciones de la turba: utilizar las mismas usadas para el recuento    de viables en caja
  • Trasplantar una plántula por tubo
  • Inocular 3 plantas por cada dilución con 1 ml por tubo de las diluciones -1 a -6 llevar a invernáculo o cámara de cultivo.
  • Luego de 4 semanas observar las plantas noduladas.
  • La interpretación de los resultados se hace con las tablas de Brockwell,1963.

Lectura de resultados:

Si tenemos los siguientes valores (plantas noduladas, obtenidas en las diluciones(10-1 a 10-6), el procedimiento es:

DILUCION             1    2    3    4     5     6

PLANTAS CON

NODULOS               3    3    2    1    0     0

(Tabla de Brockwell 1963 )

Numero característico 332.100 el número estimado es 1470

Para referirlo a la suspensión inicial y expresar en

número de rhizobios por gm. de turba =  Número estimado x volumen de agua

                                                                                     g de turba

Técnica de NMP

Objetivo: esta técnica permite calcular la concentración de células viables, implica una deducción matemática del recuento de una fracción de la muestra.

Se observa si se forman colonias o nódulos en una serie de tubos con el medio de cultivo adecuado. La evaluación se realiza por observación de  los tubos, donde no hay desarrollo se presume que no recibieron 1 microorganismo en condiciones de crecer.

Figura 6: Estimación del error, en función del número de muestras.

Referencia :Manual de métodos de bacteriólogos americanos

El coeficiente de variación usando NMP se realiza en función del % de tubos estériles (abcisa inferior) y del número promedio de células por tubo (abcisa superior).

El óptimo se observa a 20.8% de tubos estériles y 1.59 como promedio de células por tubo y corresponde al número de tubos usados.

Si se compara el desarrollo en tubo con el de cajas de Petri, desde el punto de vista estadístico es poco eficiente, el primero, pues cada tubo corresponde a una fracción de caja de Petri, por ello deben usarse muchas repeticiones de tubos.

Cuando el método es una ventaja?

  • Si la bacteria no se puede cultivar en medio sólido
  • Si la cinética del crecimiento es variable.
  • Si la bacteria a estudiar presenta alguna característica observable (color), turbidez, antibiótico etc. Por ejemplo, en esta situación la formación de nódulos , los cuales no se podrían obtener desarrollando las plantas en cajas de Petri.

Esta técnica también  puede utilizarse para evaluar distintos parámetros en por ej. en el análisis de aguas, de alimentos, etc.

Respecto al recuento de nódulos existe una correlación positiva entre número de células viables infectivas y efectivas de rhizobios y el número de nódulos formados.

Es decir primero deben hacerse varias diluciones y descartar aquellas donde el porcentaje de tubos estériles es menor de 8 ó mayor de 36%, el error corresponde al coeficiente de variación.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN LA SEMILLA INOCULADA

Precauciones   

  • Debe realizarse una agitación corta y vigorosa en agua estéril
  • Deben recuperarse todas o la mayoría de las bacterias

RECUENTO DE RHIZOBIUM VIABLES E INFECTIVOS (para inoculante oleoso)

Preparación del material:

  • Agregar 8 g de Span 80 a una botella de 250 cm3 con tapa a rosca y 10 g de perlas de vidrio.
  • Agregar 80 cm3  de solución de Tween 80 a una botella de 250 cm3 con tapa a rosca (solución de Tween 80: 20 g de Tween 80 en 800  cm3 de agua destilada.
  • Esterilizar ambas botellas a 1kg/cm2 durante 20 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.
  • Esterilizar 10 botellas con 90   cm3 de solución fisiológica pH controlado a 7. Las botellas deben esterilizarse siempre con la tapa floja y sin el inserto plástico.
  • Esterilizar pipetas de 1 y 10 ml.

Marcha del análisis:

Agitar fuertemente el envase de inoculante líquido por varios minutos de arriba hacia abajo, hasta que se vea que el contenido del envase está homogéneo.

Sobre el contenido de la botella esterilizada de span 80 y perlas de vidrio agregar 10 g del inoculante, sobre balanza con pipeta.

Mezclar generosamente la muestra con el Span y las perlas de vidrio.

Agregar la solución Tween 80 a la botella anterior, con la cual se completan 100 ml. y tenemos la muestra diluida al décimo.

Agitar vigorosamente esta primera dilución a mano o con vortex durante varios minutos, esta etapa es crítica ya que si no se efectúa correctamente las bacterias no se transfieren a la fase acuosa.

Las siguientes diluciones se realizan al décimo con las botellas de solución fisiológica y con pipetas de 10 ml, agitando cada una de ellas a mano o con vortex.

Las siembras en placa se efectúan utilizando estas diluciones.

Para el recuento de NMP se pueden usar estas diluciones.

METODO DE EVALUACION DE LA NODULACION

Datos proporcionados por la Ing. Agr. Marisa D'Alonso de ex IASCAV, actualmente SENASA

  • Soporte: vermiculita  o dolomita esterilizada por autoclave 121 0C 1 atm. de sobrepresión.
  • Recipiente: potes plásticos de 200 cc con 4 orificios y 50 repeticiones por cada muestra de producto. (para llegar a un mínimo de 30 plantas finales).Las bandejas para riego serán individuales o para un grupo. Los recipientes deberán tener vermiculita hasta 1.5 cm del borde superior y previo a la siembra se regarán con solución buffer hasta saturación, para neutralizar.
  • Semilla grande: pesar 2 Kg de semilla de soja e inocular según indicaciones del fabricante, mezclar hasta obtención de una adhesión homogénea del producto. Luego sembrar 1 semilla por vaso y realizar  testigos sin inocular.
  • Semilla pequeña: pesar 1 kg. de semilla sin esterilizar luego inocular según indicación del fabricante, se sembrarán en condiciones asépticas 20 semillas por vaso y colocar en oscuridad hasta germinación, regar desde abajo con agua destilada y se continuará de la misma forma que en leguminosas de grano grande también realizar testigos.
  • Llevar a invernáculo en oscuridad hasta germinación del 50% como mínimo y a los 21 días se da por finalizado la experiencia.
    Se consideran positivas las plantas con 3 o mas nódulos fijadores sobre las 2.5 cm de longitud ( contados a partir del cuello de la planta) y 2.5 cm de diámetro. Con el 80% de plántulas positivas se aprobará el producto.

  • Condiciones de invernáculo
    • Fuente de luz 2 tubos tipo Grolux por cada tubo de luz de día
    • Densidad aproximada, 20 tubos por metro lineal.
    • Altura: 40 cm, tomados a partir del borde superior del vaso o pote
    • Luminosidad: aproximadamente 4.600 lux
    • Temperatura ideal :máxima 30 0C mínima 25 0C nocturna 20 0C
    • Humedad relativa: 65%.

METODO DE EVALUACIÓN DE LA NODULACIÓN

Técnica de Burton (aprobada por Senasa)

  • Pasar la vermiculita por malla 8 y que se retenga en la malla 20
  • Colocar 45 g de vermiculita por vaso plástico
  • Agregar aproximadamente 120 ml de solución de riego
  • Sembrar 2 semillas de soja inoculadas por vaso
  • Preparar bandejas plásticas con suficientes vasos ( mínimo 32 plantas)
  • Observar a los 14 días de emergidas

Solución de riego:   KH2PO           0.7 g.L

                             K2HPO           0.5 g.L Ajustar a pH 6.8

Desde hace mas de 40 años el Departamento de Microbiología de Suelos de Uruguay están investigando la calidad de los inoculantes comerciales para leguminosas. Se agrega un trabajo sobre la calidad.

[temario]

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